Флори е роден в Аделаида, Южна Австралия, син на училищен директор. Посещава колежа Сейнт Петър в Аделаида и Университета на Аделаида, където завършва бакалавърска степен през 1921 г. и докторска степен по медицина през 1924 г.
След като завършва медицината си, Флори работи в Института за медицински изследвания Уолтър и Елиза Хол в Мелбърн, където се запознава с Ернст Чейн. През 1928 г. те се преместват в Училището по патология на сър Уилям Дън към Оксфордския университет, където започват работа по разработването на пеницилин.
Пеницилинът е открит през 1928 г. от Александър Флеминг, но не е превърнат в използваемо лекарство. Флори и Чейн успяват да изолират активната съставка на пеницилина и да го пречистят, за да може да се инжектира на пациенти. Те също така разработват методи за масово производство на пеницилин, което прави възможно широкото му използване по време на Втората световна война.
Работата на Флори и Чейн върху пеницилина спасява безброй животи по време на Втората световна война и революционизира лечението на инфекциозни заболявания. Флори е удостоен с Нобелова награда за физиология или медицина през 1945 г. и е посветен в рицар през 1944 г.
Флори също беше изтъкнат администратор и преподавател. Той е бил заместник-канцлер на Оксфордския университет от 1959 до 1962 г. и е бил президент на Кралското общество на Лондон от 1960 до 1965 г. Той също така е член на Австралийската академия на науките, Американската академия на изкуствата и науките и Националната академия на науките.
Флори умира от инсулт в Оксфорд през 1968 г. Той е смятан за един от най-важните австралийски учени на 20-ти век, а работата му върху пеницилина е спасила милиони животи.